1. 該模型鑒定和評(píng)價(jià)的技術(shù)方法和指標(biāo)體系，符合潰瘍性結(jié)腸炎的病理特點(diǎn)，尤其與潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的臨床特點(diǎn)高度相似。

（1） 疾病活動(dòng)指數(shù)

（2） 結(jié)腸指數(shù)

（3） 結(jié)腸組織大體評(píng)分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測(cè)

2. 與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

現(xiàn)有的潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法有單一化學(xué)法刺激、免疫法、免疫復(fù)合法、基因修飾法。雖然現(xiàn)在建造UC動(dòng)物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡(jiǎn)單易操作，同時(shí)盡可能全面、準(zhǔn)確的模擬人類UC的病理生理學(xué)特點(diǎn)和表現(xiàn)，既要與自發(fā)的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進(jìn)展、組織損傷進(jìn)展等，同時(shí)模型病變盡量維持較長(zhǎng)時(shí)間，能盡量反映慢性病變的過程和特點(diǎn)，以滿足實(shí)驗(yàn)的需求。而目前尚缺乏能滿足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復(fù)性、穩(wěn)定性，并且操作簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型，從而為研究UC發(fā)病機(jī)制、研發(fā)治療新藥物提供良好的基礎(chǔ)。

3. 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)或技術(shù)關(guān)鍵

3.1 創(chuàng)新點(diǎn)

本模型采用誘導(dǎo)劑聯(lián)用的方法，建立慢性、炎癥維持時(shí)間長(zhǎng)且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進(jìn)了傳統(tǒng)潰瘍性結(jié)腸炎模型的病程短、穩(wěn)定性差、模型指標(biāo)缺少特異性等問題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結(jié)腸炎病理指標(biāo)。

3.2 關(guān)鍵技術(shù)

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)用、致敏與感染相結(jié)合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時(shí)間長(zhǎng)且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過閱讀大量中外文獻(xiàn)，較充分的了解潰瘍性結(jié)腸炎疾病以及模型建立過程中的問題。

4.2 實(shí)驗(yàn)單位具備動(dòng)物飼養(yǎng)許可證以及較先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)器材和檢測(cè)設(shè)備。

4.3 通過閱讀大量中外文獻(xiàn)和走訪調(diào)研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應(yīng)用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級(jí)。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動(dòng)物用水為實(shí)驗(yàn)室制UP水經(jīng)過除菌處理。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均于具有檢驗(yàn)合格資質(zhì)的SPF級(jí)屏障動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入屏障實(shí)驗(yàn)室，觀察室適應(yīng)7天后無異常情況，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)中小鼠均引頸處死，盡量減少動(dòng)物手術(shù)創(chuàng)傷程度及失血量。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

一、肝臟大體形態(tài)變化

腹腔注射CCl4的油劑溶液（50ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續(xù)注射4周，取肝臟組織。

圖1肝臟大體形態(tài)

二、肝臟纖維化指標(biāo)檢測(cè)

腹腔注射CCl4的油劑溶液（50ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續(xù)注射4周，取肝臟組織行Western Blot檢測(cè)肝纖維化相關(guān)蛋白

圖2 肝臟組織纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)情況

三、肝臟馬松染色

腹腔注射CCl4的油劑溶液（50ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續(xù)注射4周，取肝臟組織，10%福爾馬林固定，制成石蠟切片行馬松染色。

圖3 肝臟組織馬松染色

1.C57小鼠，

品系來源 ：1)遺傳背景及亞系:1921年Ltle用 Abbg Lathrop的小鼠株雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配，而得C57BL6。亞系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。 (2)毛色基因標(biāo)記：aa、BB、CC（黑色）

(3)主要遺傳學(xué)特征：a免疫學(xué)特征：一般飼養(yǎng)條件下免疫球蛋白的量隨年齡而增加，而到生后20個(gè)月時(shí)則1gG增長(zhǎng)緩慢，無菌飼養(yǎng)的絕對(duì)量較低。IgM水平較高，出生12月以后，有的個(gè)體超過80ug/mL。無菌飼養(yǎng)的動(dòng)物lgM量比一般飼養(yǎng)的高。細(xì)胞免疫低下者少見，這可能與自發(fā)腫瘤少有關(guān)。b。形態(tài)學(xué)特征：在新生鼠中，雌鼠為16.8%，雄鼠3%為小眼或無眼癥。0.6%后肢可見多趾癥，另外水頭癥占2%~4%，耳頭癥占0.4%，交合不全占3%。c生理學(xué)特性：有強(qiáng)嗜酒精性。對(duì)放射性照射為中等強(qiáng)度感應(yīng)度，LD50為630+4R，將雄鼠皮膚移植到同系的雌鼠身上，約20日被排斥掉，這是因?yàn)樵诮M織相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常顯著。d癌發(fā)生率：乳癌發(fā)生率低,不足1%，白血病為7%-16%化學(xué)致癌成功率低，放射性照射較容易誘發(fā)肝癌。

2.肝纖維化對(duì)照小鼠：C57 小鼠 ，名稱：C57。

3.誘導(dǎo)方法：腹腔注射CCl4的油劑溶液（50 ul/10g體重，CCl4：橄欖油=1:9），每周注射三次，隔一天一次，連續(xù)注射4-6周，每周稱重一次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，禁食4小時(shí)，取血液測(cè)量血生化等指標(biāo)，取肝臟進(jìn)行稱重，病理及相關(guān)蛋白分析。

肝纖維化是一個(gè)病理生理過程，是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生。任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的過程，如果損傷因素長(zhǎng)期不能去除，纖維化的過程長(zhǎng)期持續(xù)就會(huì)發(fā)展成肝硬化。臨床癥狀常見疲乏無力、食欲減退、慢性消化不良、出血等。治療主要是針對(duì)原發(fā)病的病因治療。病因多見于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等。

四氯化碳動(dòng)物模型是目前應(yīng)用于抗肝損傷和纖維化藥物評(píng)估的主要研究模型。其作用機(jī)制為：在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，四氯化碳被肝微粒體細(xì)胞色素P450氧化酶激活后生成三氯化碳，與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，破壞肝細(xì)胞功能。此外，還可攻擊肝細(xì)胞膜的磷脂，引起脂質(zhì)過氧化破壞膜性結(jié)構(gòu)，損傷肝細(xì)胞。