采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進行病毒核酸檢測（圖3），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。

2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化

運用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對重癥小鼠模型的各組織器官進行病理學(xué)觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進行組織病理學(xué)觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細胞浸潤，主要有淋巴細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細胞源性水腫，神經(jīng)元發(fā)生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)紅色神經(jīng)元，并可見衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細胞浸潤，肺泡間隔毛細血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在上述嚴重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

3.重癥小鼠模型血清細胞因子檢測

對重癥小鼠模型進行血清細胞因子檢測從血清細胞因子方面揭示重癥發(fā)生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時間點的爆發(fā)性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍；48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素，并且細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發(fā)揮重要作用。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低，符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L，PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血氣結(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。

5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中，肌細胞內(nèi)可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現(xiàn)為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發(fā)生退行性變，細胞內(nèi)出現(xiàn)水腫，部分肌原纖維發(fā)生溶解，肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少，糖原顆粒甚至消失；線粒體腫脹、空化，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化；骨骼肌細胞核固縮，染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)明顯增多，發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤。

對照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，平行或不規(guī)則排列，其間游離存在核糖體；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰；腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻。感染組腦組織超微病變輕微，神經(jīng)元細胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，線粒體豐富；神經(jīng)元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹；有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離，導(dǎo)致小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變。

對照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細胞器豐富；脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，出現(xiàn)尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質(zhì)增多，細胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴張，細胞質(zhì)呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數(shù)量減少。小膠質(zhì)細胞包圍吞噬神經(jīng)元細胞，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象。

對照組肺組織中I型上皮細胞扁平，其細胞核內(nèi)可見呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì)，胞質(zhì)少而薄，胞漿內(nèi)可見少量細胞器，與周圍細胞連接緊密；肺組織中的II型上皮細胞核大而圓，常染色質(zhì)細密，異染色質(zhì)少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細胞器豐富；II型上皮細胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體。感染組肺組織中I型上皮細胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，并且與周圍細胞之間連接松弛；肺組織中II型上皮細胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核周細胞質(zhì)電子密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細胞器減少，胞質(zhì)出現(xiàn)細小空泡變，嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象，溶酶體增多；肺泡壁中的細胞成分增多，其中肺泡II型上皮細胞增生，發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風(fēng)險的病原，人類感染風(fēng)險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進行病原學(xué)實驗，在ABSL-2實驗室進行動物實驗。

pCMV6-XL5-h-SCARB2質(zhì)粒購自美國Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)質(zhì)粒中巨細胞瘤病毒（CMV）啟動子下游，構(gòu)建全身表達人SCARB2的載體。轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)測序驗證后，用Pvu I將載體線性化，Sephedex G50柱純化。將DNA濃度調(diào)整至5 ng/uL，用顯微注射法將DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)鼠尾DNA PCR對首建鼠的基因型進行鑒定，得到陽性首建鼠3只（圖1A）。隨后，用逆轉(zhuǎn)錄PCR分析了首建鼠F1代組織中目的基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)人SCARB2主要在轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌和腦組織中表達（圖1B）。隨后，分別用Western Blot和免疫組化分析了人SCARB2蛋白在腦和骨骼肌組織中的表達情況。由于人SCARB2與小鼠SCARB2同源性較高，存在抗體交叉結(jié)合現(xiàn)象。Western Blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腦和骨骼肌組織中SCARB2蛋白表達量高于同窩陰性（圖1C-1D）。免疫組化發(fā)現(xiàn)SCARB2蛋白主要分布于轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌和腦組織中（圖2A-2B），該結(jié)果表明成功建立了腦和肌肉組織表達人SCARB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。

注：M：DNA分子質(zhì)量標準；1-15：首建鼠；NTG：同窩陰性小鼠；TG：轉(zhuǎn)基因小鼠；A：PCR鑒定陽性首建鼠；B：逆轉(zhuǎn)錄PCR分析轉(zhuǎn)基因小鼠組織內(nèi)人SCARB2基因表達；C： Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達，GAPDH為內(nèi)參；D： Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織中的表達，GAPDH為內(nèi)參。

Note: M: DNAmolecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line; NTG: Negative littermates; TG: Transgenicmice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNAas template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 geneexpression in tissues of Tg mice; C: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDHexpression

EV71感染SCARB2轉(zhuǎn)基因幼鼠表型

為研究表達人SCARB2對EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠的促進作用。我們分別用MP10毒株感染不同年齡段的小鼠，發(fā)現(xiàn)兩周齡以下的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在感染病毒后，會于10天內(nèi)死亡，肌肉組織內(nèi)病毒載量超過108拷貝/毫克，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在病毒復(fù)制方面差別不大。因此，我們用２ ×１０６ ＴＣＩＤ５０MP10毒株200uL分別感染了21日齡的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，主要研究了表達人SCARB2受體組織內(nèi)的病毒復(fù)制情況。發(fā)現(xiàn)在感染后3天（病毒復(fù)制的最高峰）轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌和腦中EV71的拷貝數(shù)顯著高于同窩陰性小鼠（圖3A-3B），隨后，用免疫組化研究了組織內(nèi)的病毒分布情況。EV71抗原主要分布于轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中，而野生型小鼠腦組織中未檢測到病毒抗原（圖4A）。轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織內(nèi)均分布著大量的EV71抗原，與和野生型小鼠比兩者間差異明顯（圖4B）。表明表達人SCARB2可促進EV71對轉(zhuǎn)基因小鼠組織的感染，證實該蛋白在體內(nèi)可發(fā)揮EV71受體的功能。

SCARB2轉(zhuǎn)基因動物模型，無特定病原體(specific-pathogen free，SPF) ICR小鼠，6周齡，雌性，體重18-20g。

背景品系為ICR封閉群小鼠， Hauschka用Swiss小鼠群以多產(chǎn)為目標，進行選育，以后美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research）分送各國飼養(yǎng)實驗，各國稱為ICR。

人腸道病毒71型（EV71）是微核糖核酸病毒科腸病毒屬腸病毒種A型RNA病毒， 1969年首次在加利福尼亞神經(jīng)異常的病人體內(nèi)分離并鑒定。EV71被認為是嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原體之一。該病毒感染偶爾伴隨嚴重的并發(fā)癥，包括腦干腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性弛緩性麻痹和心力衰竭。最近幾十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范圍內(nèi)大爆發(fā)，目前主要集中于亞太地區(qū)。中國大陸的EV71病毒感染始見于1987年冬季湖北省HFMD的流行，自1999年以來，我國廣東、福建、上海、重慶等地區(qū)也報告了局部流行的EV71感染，與1998年臺灣地區(qū)報道120,000例爆發(fā)手足口病，其中有78例死亡不同，大陸EV71引起的HFMD和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀較輕。以往研究認為人脊髓和腦干是EV71感染的靶標，但其感染機制和致病機制尚不明確。

2009年日本學(xué)者首次利用細胞實驗鑒定了EV71的兩種人受體蛋白，分別為P選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)和人清道夫受體B2（SCARB2）。通過建立表達PSGl-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，我們證實人PSGL-1有一定的促進EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠的功能。為進一步在體內(nèi)證實人SCARB2的受體功能，以期改良現(xiàn)有的EV71感染小鼠模型，我們通過建立表達人SCARB2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在體內(nèi)驗證了該蛋白的受體功能。