動物癥狀觀察：

表現(xiàn)為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個月后死亡。

實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)(ILAS-GC-2012-001)。

1.多巴胺D5受體D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠血壓值

分別測量D5F173L、D5S390G和hD5WT小鼠以及陰性對照小鼠血壓值，組間比較結(jié)果顯示：D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠三至六月齡收縮壓、舒張壓和平均動脈壓都明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠(* P<0.05 vs. D5WT, 陰性對照, n=6，t test) 。

圖1.D5F173L、D5S390G和D5WT轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账膫€實(shí)驗(yàn)組小鼠三月齡至六月齡收縮壓、舒張壓及平均動脈壓比較.

1.2 比較各組小鼠收縮壓，舒張壓及平均壓隨時間變化情況（三月齡至六月齡），分析結(jié)果顯示：各組小鼠隨月齡增加收縮壓差異無顯著性變化(* P>0.05 ,n=6，t test)； D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠舒張壓隨年齡增加呈有上升趨勢，且四月齡較三月齡比較有顯著性差異(*P<0.05 ,n=6，t test)，其他各組轉(zhuǎn)基因小鼠舒張壓無明顯變化(*P>0.05 ,n=6，t test)；D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠平均壓隨年齡增加有上升趨勢，但各月齡間無顯著性差異 (* P>0.05,n=6，t test)，其他各組轉(zhuǎn)基因小鼠平均壓無明顯變化趨勢(* P>0.05,n=6，t test)。

圖2 四組小鼠的收縮壓，舒張壓及平均壓隨月齡變化分析（三月齡至六月齡）

A：各組基因小鼠及陰性對照小鼠三月齡至六月齡收縮壓比較

B：各組基因小鼠及陰性對照小鼠三月齡至六月齡舒張壓比較

C：各組基因小鼠及陰性對照小鼠三月齡至六月齡平均壓比較

2.心臟超聲結(jié)果

2.1 心臟超聲，主動脈瓣血流多普勒頻譜圖像:顯示小鼠左心室結(jié)構(gòu)，獲得左心室運(yùn)動曲線，主動脈瓣血流頻譜圖像。

圖3 左室M超，主動脈瓣血流及組織多普勒頻譜圖像

A: M超顯示左室長軸乳頭肌水平左室運(yùn)動曲線

B: M超顯示左室短軸乳頭肌水平左室運(yùn)動曲線脈沖

C: 多普勒測定的主動脈瓣血流頻譜

2.2 左心室內(nèi)體積分析顯示：D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期和收縮末期左室內(nèi)體積均明顯低于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (* P<0.01 vs D5WT, 陰性對照, n=6，t test)，提示多巴胺D5突變基因173L(D5F173L)轉(zhuǎn)基因小鼠血壓升高后可引起心臟繼發(fā)性左心室室腔增大。

圖4 四月齡至六月齡多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L), S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期和收縮末期左室內(nèi)體積比較：

A:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠四月齡舒張末期和收縮末期左室內(nèi)體積比較。

B:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠五月齡舒張末期和收縮末期左室內(nèi)體積比較。

C:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠六月齡舒張末期和收縮末期左室內(nèi)體積比較。

2.3 舒張末期左室內(nèi)徑，左室前后壁及左室收縮功能相關(guān)性分析顯示：

a）左室內(nèi)徑變化：四到六月齡D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期左室內(nèi)徑均明顯低于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠(* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

b)左室前壁變化：D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期左室前壁與hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠相比四月齡無顯著性變化，五月齡及六月齡明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (* P<0.05 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

c)左室后壁變化：四到六月齡D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期左室后壁均明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

d）D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期左室內(nèi)體積與左室內(nèi)徑隨月齡的增加均呈顯著性減小的趨勢且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=6，t test），同時其舒張末期左室前后壁厚度則呈顯著性增加。

圖5 四月齡至六月齡多巴胺D5突變基因F 173L (D 5F 173L ),S 390G (D5S 390G )及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉(zhuǎn)基因小鼠舒張末期左室內(nèi)徑，左室前后壁厚度比較：

A:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠四月齡舒張末期左室內(nèi)徑及左室前后壁比較。

B:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠五月齡收縮末期左室內(nèi)徑及左室前后壁比較。

C:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠六月齡舒張末期左室內(nèi)徑及左室前后壁比較。

圖6 四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左心室相關(guān)參數(shù)隨年齡的變化：

A:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室內(nèi)體積隨月齡增加的比較。

B:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室內(nèi)徑隨月齡增加的比較。

C:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室前壁隨月齡增加的比較。

D:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室后壁隨月齡增加的比較。

2.4 收縮末期左室內(nèi)徑，左室前后壁及左室收縮功能相關(guān)性分析顯示：

a)內(nèi)徑變化：四到六月齡D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期左室內(nèi)徑均明顯低于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

b)前壁變化：D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期左室前壁與hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠相比四月齡無顯著性變化 (* P>0.05 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；五月齡及六月齡D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期左室前壁均明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

c)后壁變化：四到六月齡D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期左室后壁均明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠 (* P<0.01 vs. hD5WT, 陰性對照, n=6，t test)；

d) D5F173L轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期左心室內(nèi)體積與左心室內(nèi)徑隨月齡的增加顯著減小（P<0.05，n=6，t test），收縮末期左室前后壁厚度顯著性增加（P<0.05，n=6，t test）；其余三組小鼠收縮末期左室內(nèi)體積、左室內(nèi)徑及左室前后壁隨月齡有變化趨勢但無顯著性差異（P>0.05，n=6，t test）。

圖7 四月齡至六月齡多巴胺D5突變基因F 173L (D 5F 173L ),S 390G (D5S 390G )及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期左室內(nèi)徑，左室前后壁厚度比較

A:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠四月齡收縮末期左室內(nèi)徑及左室前后壁比較。

B:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠五月齡收縮末期左室內(nèi)徑及前后壁比較。

C:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠六月齡收縮末期左室內(nèi)徑及前后壁比較。

圖8 四組小鼠舒張末期左室內(nèi)相關(guān)參數(shù)隨月齡的變化：

A:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室內(nèi)體積隨月齡增加的比較。

B:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室內(nèi)徑隨月齡增加的比較。

C:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室前壁隨月齡增加的比較。

D:四個實(shí)驗(yàn)組小鼠舒張末期左室后壁隨月齡增加的比較。

2.5 左心室縮短分?jǐn)?shù)分析顯示： D 5F 173L 轉(zhuǎn)基因小鼠左心室縮短分?jǐn)?shù)四至六月齡均明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠，且隨月齡增加差異顯著性增加(* P<0.01 vs. D5WT, 陰性對照, n=6，t test) 。

圖9 多巴胺D5突變基因F 173L (D 5F 173L ),S 390G (D5S 390G )及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉(zhuǎn)基因小鼠左心室縮短分?jǐn)?shù)的變化

A:各實(shí)驗(yàn)組小鼠四至六月齡間左室縮短分?jǐn)?shù)比較。

B:同月齡內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組小鼠左心室縮短分?jǐn)?shù)比較。

2.6左心室重量分析：D 5F 173L 轉(zhuǎn)基因小鼠左室重量四至六月齡均明顯高于hD5WT轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠，且隨月齡增加差異顯著性增加(*P<0.05 vs. D5WT, 陰性對照, n=6，t test)

圖10 多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L),S390G(D5S390G)及正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉(zhuǎn)基因小鼠左室重量的變化

A:四組小鼠同月齡內(nèi)左室重量比較。

B:四組小鼠四至六月齡間左室重量比較。

該結(jié)果表明血壓升高過程中左室心肌細(xì)胞發(fā)生肥大，從而引起多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L)轉(zhuǎn)基因小鼠左心室的重構(gòu)。

3. 腎組織病理切片HE染色及免疫組化結(jié)果顯示：多巴胺D5突變基因F173L(D5F173L)轉(zhuǎn)基因小鼠腎小球球囊間隙較正常人D5基因(hD5WT)（對照）轉(zhuǎn)基因小鼠稍微變窄，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Na-K-ATP酶表達(dá)有所增加。

圖2.多巴胺D5突變基因DF173L及正常人D5基因(hD5WT)轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織HE染色及Na-K-ATP酶免疫組化結(jié)果

A: 正常人hD5WT基因轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織HE染色。

B: 多巴胺D5突變基因DF173L轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織HE染色

C: 免疫組織化學(xué)檢測Na-K-ATP酶在轉(zhuǎn)正常人hD5WT基因小鼠腎組織中的表達(dá)

D: 免疫組織化學(xué)檢測Na-K-ATP酶在轉(zhuǎn)突變基因多巴胺D5F173L小鼠腎組織中的表達(dá)

D5F173L轉(zhuǎn)基因多巴胺小鼠模型。

背景品系為C57BL/6小鼠，屬于動物界、脊索動物門、脊椎動物亞門、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、家鼠屬、家鼠種的動物，1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL，1937年從C57BL分離出C57BL/6亞系培育而成。

由美國喬治敦大學(xué)Pedro A. Jose博士惠贈的pcDNA-h-D5F173L表達(dá)載體人D5F173L質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，搖菌擴(kuò)增后測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast分析，顯示得到的pcDNA-D5-F173L與Genebank 中序列對比得到目的突變位點(diǎn)正確。用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL小鼠的受精卵中，用C57BL小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠用堿裂解法提取基因組DNA。PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因首建鼠及其子代基因型。Western blot檢測轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織中D5R的表達(dá)。（圖1,圖2）

圖1 F1代轉(zhuǎn)基因鼠的PCR檢測

P：陽性對照；H：空白對照；N：陰性對照； M：DL2000 圖中37 9 10 15 17 20

21 22 24 27 33 34 35為F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；

圖2 Western Blotting 鑒定D5 F173L轉(zhuǎn)基因小鼠D5受體蛋白在腎臟的表達(dá)

1:野生型對照小鼠，2:32號首建鼠的F1代小鼠，3:4號首建鼠的F1代小鼠，

4:16號首建鼠的F1代小鼠

原發(fā)性高血壓是指原因不明，以動脈收縮壓和（或）舒張壓增高為特征，常伴有心、腦、腎等器官病理性改變的全身性疾病。原發(fā)性高血壓占高血壓患者的95%以上，在我國的影響人口超過1億人。高血壓對心臟、腎臟、腦均有影響，還可以造成眼底動脈硬化導(dǎo)致失明等并發(fā)癥。

原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為是基因和環(huán)境相互作用的共同結(jié)果，流行病學(xué)調(diào)查表明, 原發(fā)性高血壓有明顯的遺傳傾向。近20年來的研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺通過抑制腎小管鈉的重吸收，對原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用[1][2]，其可以通過自分泌/旁分泌的方式分泌到腎小管管腔、調(diào)節(jié)RPT段和髓袢升支粗段中的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)，可在腎單位的多個節(jié)段上抑制Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，還可以通過抑制Na+-K+-ATPase活性實(shí)現(xiàn)利尿作用。多巴胺是通過多巴胺受體影響鈉的重吸收從而發(fā)揮其功能，近期的研究發(fā)現(xiàn)D5受體基因位點(diǎn)（chromosome4p15.1-16.1）與原發(fā)性高血壓有相關(guān)性，人D5受體基因多態(tài)性相關(guān)功能異常，包括 L88F、F173L、A269V、P330Q、C335X、N351D、S390G和S453G，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染D5突變基因F173L后， CHO細(xì)胞刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性降低, O2-產(chǎn)量顯著增加，因此,我們構(gòu)建了D5F173L全身表達(dá)及心臟特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠 ,從而進(jìn)一步研究多巴胺D5受體在高血壓及心肌病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D5F173L全身表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。