該動物模型已在多種疾病中進行了應(yīng)用，技術(shù)方法和指標(biāo)體系相對成熟，在流感病毒、柯薩奇病毒等急性病毒感染評價中應(yīng)用鮮有報道，我們的結(jié)果提示，該感染模型的研究對于CRP在急性病毒感染的致病機制評價以及以治療為目的的潛在靶向分子干預(yù)研究中將發(fā)揮積極作用。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠在賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標(biāo)準(zhǔn)的動物模型制備相關(guān)完備監(jiān)督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規(guī)定進行，實驗動物尸體實行無害化處理，對生態(tài)環(huán)境無影響。

1、CRP基因敲除小鼠鑒定

采集鼠尾組織提取DNA，分別通過PCR和測序的方法對構(gòu)建的F1代和傳代CRP基因敲除小鼠進行表型鑒定，結(jié)果顯示，CRP敲除小鼠能夠穩(wěn)定傳代。

圖1 CRP基因敲除小鼠PCR鑒定結(jié)果:（A）F1代純合子小鼠鑒定結(jié)果；（B）傳代小鼠3代以上純合子小鼠鑒定結(jié)果。

2、分別用甲型H1N1流感病毒2009大流行株、甲型H1N1小鼠適應(yīng)株P(guān)R8、人H7N9禽流感病毒、人H5N1禽流感病毒株、柯薩奇B3病毒感染CRP基因敲除鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠, 結(jié)果顯示，相對野生鼠，甲型H1N1流感病毒2009大流行株和H7N9禽流感病毒在CRP基因敲除鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因鼠中均表現(xiàn)更高的致病性和致死性，病毒在肺組織中有效復(fù)制，造成支氣管肺炎病理表現(xiàn)。而柯薩奇病毒B3在CRP基因敲除鼠較野生鼠沒有明顯的體重損失，而在人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠，其體重損失與野生鼠相似，但心肌炎病理改變更為明顯。人H5N1禽流感病毒和甲型H1N1小鼠適應(yīng)株P(guān)R8感染模型正在進行中。

圖2 病毒感染CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠體重和致死率變化。（A）甲型H1N1流感病毒2009大流行株感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠(CRP-KI)體重和致死率變化;(B)H7N9禽流感病毒疫苗小鼠適應(yīng)株感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠(CRP-KI)體重和致死率變化;（B）柯薩奇病毒B3感染野生小鼠（WT）、CRP基因敲除小鼠（CRP-KO）和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠(CRP-KI)體重變化。

1、CRP基因敲除小鼠構(gòu)建

利用CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)建立CRP基因敲除小鼠（C57/6J），小鼠染色體庫：第37000000號小鼠染色體：第1號染色體，鑒定出兩個外顯子，ATG起始密碼子在外顯子1，TGA終止密碼子在外顯子2。外顯子1到外顯子2被選為靶位點，然后將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的Cas9 mRNA和gRNA注射到受精卵中進行基因敲除小鼠生產(chǎn)。通過PCR和DNA測序分析進行基因分型鑒定F0小鼠，并將其育成野生型小鼠，進行種系傳代并鑒定，篩選F1代雜合子。F1代小鼠間進行交配后產(chǎn)生F2代小鼠，對F2小鼠進行PCR基因鑒定，篩選純合子小鼠。純合子小鼠間再進行交配傳代并進行鑒定，連續(xù)傳3代，并進行鑒定，得到穩(wěn)定傳代系CRP基因敲除小鼠。 分別將流感病毒、柯薩奇病毒通過滴鼻和腹腔注射的方式感染小鼠，同時設(shè)定野生小鼠對照，定期采樣分析病毒對小鼠的感染性，同時評價病毒對小鼠的致病性，分析CRP基因敲除對病毒致病性的影響。

2、人CRP基因轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)建立人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠（C57/6J），將含有人CRP cDNA的供體載體ROSA26的gRNA與cas9mRNA共同注射進入受精的老鼠卵中，產(chǎn)生靶向敲入的后代。F0建立動物經(jīng)PCR鑒定然后進行序列分析，對野生型小鼠進行種系傳代和F1代檢測鑒定，篩選純合子小鼠。純合子小鼠間再進行交配傳代并進行鑒定，連續(xù)傳3代，并進行鑒定，得到穩(wěn)定傳代系CRP基因敲除小鼠。 分別將流感病毒、柯薩奇病毒通過滴鼻和腹腔注射的方式感染小鼠，同時設(shè)定野生小鼠對照，定期采樣分析病毒對小鼠的感染性，同時評價病毒對小鼠的致病性，分析人CRP轉(zhuǎn)基因?qū)Σ《局虏⌒缘挠绊憽?/p>

一、疾病概述

多種急性病毒性傳染病會出現(xiàn)明顯的免疫病理性損傷表現(xiàn)，從而出快速進展性重癥感染、多組織損傷等病癥，如禽流感病毒（H5N1、H5N6、H7N9）重癥感染、SARS、重癥手足口病等。其共同的表現(xiàn)是引起細胞因子風(fēng)暴或者高炎癥因子反應(yīng)，并多伴有多器官損傷的表現(xiàn)。已有的證據(jù)已經(jīng)顯示，免疫損傷在這些病毒感染的致病機制中起重要作用，有研究提示對禽流感、SARS等病毒感染進行炎癥因子的控制有助于病例的恢復(fù)。因此，免疫損傷應(yīng)是防控中不可或缺的一部分，構(gòu)建免疫損傷相關(guān)動物感染模型，對于相關(guān)傳染病的病理評估及相關(guān)控制策略的制定有著重要的意義。

二、模型背景

1、C-反應(yīng)蛋白（細胞/基因/病原/其他造模因素）信息

C-反應(yīng)蛋白(CRP)是穿透素家族成員之一，是宿主經(jīng)典急性期反應(yīng)蛋白，其通過細胞因子被激活，進而啟動補體反應(yīng)系統(tǒng)、招募免疫細胞在組織中積聚促進炎性反應(yīng)、促進組織細胞凋亡等生物學(xué)效用。CRP 是一個磁盤樣五聚體分子，由五個相同的含有206 個氨基酸的單體組成，其是一個鈣離子依賴性的免疫調(diào)節(jié)蛋白，每個CRP 單體上有兩個Ca2+的結(jié)合位點。盡管CRP 的生物功能仍然存在爭議和很多不明確的地方，但是它作為先天性免疫反應(yīng)擔(dān)任重要角色是確定的。五聚體 CRP（pCRP)主要存在于體液循環(huán)中，在一定的條件下可被分解為CRP 單體（mCRP)，而mCRP 被認為是組織細胞結(jié)合特性的效應(yīng)分子，通過膜融合、吞噬或者與配體結(jié)合在細胞表面形成微顆粒傳遞炎癥刺激信號，從而在炎癥擴散和積聚中發(fā)揮作用。

2、實驗動物背景信息

本研究采用C57BL/6J小鼠作為CRP基因敲除鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠的的構(gòu)建，C57BL/6J是第一個被全基因組測序的小鼠品系，被廣泛用于科研和藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，C57BL/6J也被廣泛用作基因工程小鼠的背景品系。此外C57BL/6J對多種病毒敏感，可作為流感病毒、柯薩奇病毒等感染模型使用。

3、研究背景

C反應(yīng)蛋白（C reaction protein, CRP）是一種重要的炎癥反應(yīng)先天免疫調(diào)節(jié)因子，目前的研究顯示，CRP 具有激活補體系統(tǒng)、招募免疫細胞在組織中積聚促進炎性反應(yīng)、促進組織細胞凋亡等生物學(xué)效用。在禽流感病毒（H5N1、H5N6、H7N9）重癥感染、重癥手足口病等急性傳染病病例中，CRP均顯示明顯提高，且與疾病的轉(zhuǎn)歸存在潛在關(guān)系。因此，針對CRP在急性傳染病免疫損傷中的作用研究有著重要的意義。而CRP是一個具有高度保守性的急性期反應(yīng)蛋白，小鼠的CRP和人CRP具有高度相似性，人CRP的能夠結(jié)合小鼠的Fc?R激活補體反應(yīng)。本研究擬構(gòu)建人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠和CRP基因敲除小鼠，建立流感病毒、柯薩奇病毒等感染免疫損傷相關(guān)小鼠模型，形成感染免疫損傷評價體系，為急性傳染病的防控策略的建立提高依據(jù)。

近年來的研究顯示，CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)在心肌梗死、急性肝損傷、急性腎損傷等多種疾病研究得到應(yīng)用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 1-4。研究結(jié)果顯示， CRP在自身免疫性損傷相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用，并可能作為靶向治療的一個潛在分子。