鼠傷寒沙門氏菌可經(jīng)三種途徑穿越腸上皮屏障，進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)，通過(guò)血液循環(huán)擴(kuò)散至脾、肝、骨髓，在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞中存活，或誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡或壞死,或通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞釋放活性氧(reactive oxygen species)與活性氮中間體(reactive nitrogen intermediates)而被巨噬細(xì)胞殺死。細(xì)菌感染后，采集血漿，PCR檢測(cè)細(xì)菌核酸，證明動(dòng)物感染成功。

本實(shí)驗(yàn)采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級(jí)。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動(dòng)物用水為實(shí)驗(yàn)室制UP水經(jīng)過(guò)除菌處理。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均于具有檢驗(yàn)合格資質(zhì)的SPF級(jí)屏障動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入屏障實(shí)驗(yàn)室，觀察室適應(yīng)7天后無(wú)異常情況，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)中小鼠均引頸處死，盡量減少動(dòng)物手術(shù)創(chuàng)傷程度及失血量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入人體腸道后，能夠入侵并存活于小腸上皮細(xì)胞，這一過(guò)程通常會(huì)造成人體腸道的炎癥。此后，鼠傷寒沙門氏菌能通過(guò)刷狀緣上皮細(xì)胞，被轉(zhuǎn)移到淋巴組織中，從而擴(kuò)散到其它組織。在這個(gè)過(guò)程中，鼠傷寒沙門氏菌在淋巴細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞中存活和繁殖，并逃避人體免疫系統(tǒng)捕殺的能力，是它能造成系統(tǒng)性感染的關(guān)鍵原因。小鼠狀態(tài)不佳，毛色發(fā)暗，行動(dòng)緩慢，自發(fā)進(jìn)食進(jìn)水減少，糞便為軟便，排便量減少，感染性小腸炎。

單次灌胃108 CFU沙門氏菌感染小鼠。

1. 研究目的及意義

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法采用噁唑酮（oxazolone, OXZ）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）序貫給藥灌腸，誘導(dǎo)制備小鼠遷延性潰瘍性結(jié)腸炎模型，區(qū)別于單用噁唑酮或2,4,6-三硝基苯磺酸等化學(xué)藥品造成的急性模型，癥狀和病理變化僅維持3-5天，而本方法可維持1-2個(gè)月，大大的延長(zhǎng)了模型的持續(xù)時(shí)間，同時(shí)也提高了造模的穩(wěn)定性和所模擬疾病特征性病變的持久性，更符合臨床潰瘍性結(jié)腸炎慢性遷延、反復(fù)發(fā)作的特征，對(duì)開(kāi)展?jié)冃越Y(jié)腸炎病因、病機(jī)和治療藥物的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究具有重要意義。

2. 潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）又稱慢性非特異潰瘍性結(jié)腸炎，與克羅恩病同屬于炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）[1-2]，其病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中于免疫、遺傳、環(huán)境及感染等因素，患者臨床以粘液、膿血便等消化系統(tǒng)的癥狀為主，病情反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，甚至可能導(dǎo)致結(jié)腸癌[3]。UC的顯微鏡下病理特征主要為：隱窩結(jié)構(gòu)異常，上皮細(xì)胞異常以及炎癥浸潤(rùn)。黏膜炎癥彌漫性分布，發(fā)病時(shí)主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重，并出現(xiàn)血沉、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的增多[4]。人類潰瘍形成是個(gè)緩慢的過(guò)程，由于其難愈性、易復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)而成為現(xiàn)代難治性疾病之一。目前關(guān)于該疾病的實(shí)驗(yàn)室研究模型尚不成熟，且多為急性損傷和病理模擬，缺乏良好的慢性長(zhǎng)期的動(dòng)物模型，無(wú)法準(zhǔn)確的反映人類臨床UC慢性遷延、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)[5]。建立UC動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇很廣泛，大鼠、小鼠、兔等多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都可，但方法各不相同。目前存在的造模方法有如下幾種：

2.1 化學(xué)法

2.1.1 乙酸刺激

楊永剛[6]等人采用乙酸灌腸成功建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，張忠[7]用經(jīng)肛門注入0.5 g/L肥皂水0.15 mL, 約30 min后用2g/L戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉，插入直徑3 mm的聚乙烯纖維導(dǎo)管至小鼠直腸內(nèi)深度約為1~2 cm，注入8%乙酸溶液0.15 mL的方法，結(jié)果乙酸組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞萎縮、壞死、脫落，成腸壁變薄，皺襞消失，黏膜下淋巴細(xì)胞增生并有淋巴濾泡形成。張曉峰[8]研究發(fā)現(xiàn)乙酸誘導(dǎo)UC動(dòng)物模型的作用機(jī)理與乙酸直接刺激使血管通透性增加，激肽激活，溶解纖維蛋白活性增加以及凝血機(jī)制障礙有關(guān)。乙酸誘導(dǎo)UC模型制作方法簡(jiǎn)單，成本低，短期內(nèi)可使小鼠出現(xiàn)UC明顯的癥狀及典型病理變化，是目前實(shí)驗(yàn)性UC模型中應(yīng)用最廣泛的模型之一，適合于臨床研究UC的發(fā)病機(jī)制以及新藥的研制開(kāi)發(fā)。但由于乙酸直接刺激造成結(jié)腸黏膜和血管的損傷，與臨床致病因素有較大差異，且最初黏膜損傷的非特異性炎癥呈現(xiàn)急性過(guò)程，不能表現(xiàn)人類UC所具有的慢性，復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[9]。

2.1.2 DSS法

葡聚糖硫酸鈉 (dextran sulphate sodium,DSS) 是一種肝素樣硫酸多糖體，1958 年Ohkusa[10]最早利用倉(cāng)鼠建立，閆曙光[11]采用2%葡聚糖硫酸鈉口服2周建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，Trivedi [12]通過(guò)給Swiss小鼠連續(xù)7d自由飲用3.0%DSS水溶液，之后連續(xù)14d給予普通飲水，最后再連續(xù)7d給予3.0%DSS水溶液建立DSS的慢性UC模型。但是DSS誘導(dǎo)的潰瘍模型個(gè)體差異比較明顯，且為短期急性模型，不適宜研究慢性UC引發(fā)的結(jié)腸癌相關(guān)問(wèn)題。

2.2 復(fù)合法

2.2.1 惡唑酮模型(oxazolone,OXZ)+乙醇

惡唑酮是一種半抗原物質(zhì)[13]，其誘導(dǎo)UC模型先致敏然后進(jìn)行灌腸給藥，用惡唑酮溶液對(duì)小鼠灌腸,小鼠5d后即可出現(xiàn)腸道炎癥[14]，結(jié)腸肉眼可見(jiàn)黏膜充血水腫, 糜爛潰瘍, 鏡下見(jiàn)結(jié)腸黏膜潰瘍。7d左右病情好轉(zhuǎn)，10d左右基本痊愈。利用惡唑酮建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，速度較快，重復(fù)性好且制作簡(jiǎn)單，但是疾病維持時(shí)間相對(duì)較短，小鼠模型有自愈傾向，缺少慢性過(guò)程，對(duì)于慢性復(fù)發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎的模擬度不高。

2.2.2 三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)+乙醇

采用異戊巴比妥麻醉，一定量TNBS緩慢灌腸可以誘導(dǎo)急性腸炎Wistar大鼠模型；15d以后再次給予定量TNBS灌腸可以造成復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎，可以造成復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎[15-16]，三硝基苯磺酸與乙醇灌腸一次致炎是目前最為常用的潰瘍性結(jié)腸炎模型建立方法，具有以上其他建模方法所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)。

2.3 免疫復(fù)合法

2.3.1 免疫復(fù)合物+TNBS+乙醇

譚琰等[17]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與TNBS+乙醇誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動(dòng)物模型相比，增加免疫復(fù)合物進(jìn)行復(fù)合誘導(dǎo)的方式更符合T/B淋巴細(xì)胞混合作用的要求，而且炎癥持續(xù)的時(shí)間延長(zhǎng)了3~4個(gè)星期。崔國(guó)寧[18]研究免疫復(fù)合法建立的大鼠UC模型表現(xiàn)穩(wěn)定，重復(fù)性好，病變持久，發(fā)病機(jī)制與人類UC相似，是較為理想的模型。康宜兵等[19]研究示免疫復(fù)合建立的模型成功率高，重復(fù)性好，與人類的UC相似，是較為理想的模型。具體方法：取20只SD大鼠，隨機(jī)分為模型組和空白組，每組各10只，模型組給予抗原乳化液于大鼠的背部、頸部皮下，第23天灌腸TNBS/50%乙醇，空白組以生理鹽水代替，比較各組大鼠的大便性狀、體重、便血等，并進(jìn)行組織學(xué)檢查。由此可以看出，本法建立大鼠 UC 模型持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，潰瘍的形成，與炎性反應(yīng)都有體現(xiàn)，符合臨床UC的病理要求，但缺點(diǎn)是比較繁瑣。

2.3.2 免疫復(fù)合物+乙酸

吳玉泓[20]采用局部乙酸刺激替代TNBS+乙醇灌腸，免疫致敏方法與上述相似，同樣起到了模擬人類UC慢性活動(dòng)性的特點(diǎn)，也適宜于觀察和評(píng)價(jià)藥效。

2.4 討論

UC模型最常見(jiàn)的造模方法為化學(xué)法、復(fù)合法及免疫復(fù)合法等，DSS液、TNBS液是化學(xué)法中最常用的誘導(dǎo)劑，對(duì)造模成功與否所用到的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有：疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸組織大體評(píng)分[21-22]、MPO酶活性檢測(cè)[23]，以及形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化學(xué)染色細(xì)胞觀察[24-25]等。目前對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的誘導(dǎo)大部分屬于急性病發(fā)式炎癥，偶有慢性模型誘導(dǎo)的方法，雖然現(xiàn)在建造UC動(dòng)物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷，現(xiàn)階段的UC模型遠(yuǎn)不能滿足科學(xué)研究的需要，故尋找更好，更方便，更符合人類潰瘍疾病的模型尤為重要。本實(shí)驗(yàn)方法[26-27]將OXZ與TNBS聯(lián)合灌腸給藥，按照一定周期誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型可維持一個(gè)月，使UC模型更接近人類UC發(fā)病機(jī)制及臨床癥狀，通過(guò)控制小鼠的性別、體重、健康飼養(yǎng)狀況、實(shí)驗(yàn)環(huán)境與條件等環(huán)節(jié)，觀察小鼠的行為改變情況、免疫組化、炎癥因子的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究UC的發(fā)病機(jī)制，防治方法提供符合臨床實(shí)際的、標(biāo)準(zhǔn)的、可重復(fù)的、可控易行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型的研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，是臨床UC治療藥物研究的重要基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 張晶娜,陶磊,張俊,王木嶺,陳瑩,劉衡,張成桂,何苗.美洲大蠊提取物Ento-A對(duì)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的改善作用研究[J].中國(guó)藥房,2020,31(01): 35-41.

[2]趙曼, 高峰. 潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 10(16): 3160-3165.

[3]Lakatos PL, Lakatos L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis:changes, causes and management strategines [J]. World J Gastroenterol, 2008,14(25): 3937-3947.

[4]郭 倩, 唐志鵬, 王麗娟. 潰瘍性結(jié)腸炎組織病理學(xué)診斷的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2014, 22(2): 190-196.

[5]鄭文瀟,吳翔.潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2016, 11(09):861-864+867.

[6]楊永剛,王丹丹,張艷秋,王明星.猴頭菌多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響[J].中國(guó)藥房,2019,30(20):2763-2767.

[7]張忠,程富勝,賈寧,車清明,尹鳳琴,祝艷華.小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立及病理組織學(xué)比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2012,20(06):69-72+99.

[8]張曉峰.細(xì)胞因子與潰瘍性結(jié)腸炎[J].河北醫(yī)學(xué), 2001, 7 (5) :465-467.

[9]霍麗娟, 趙和平.實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 35 (5) :467-470.

[10] 閆曙光,惠毅,李倩,李京濤,魏海梁.黃連-干姜提取物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸上皮TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2020,26(04): 70-75.

[11]Ohkusa T. Production of experimental ulcerative colitis in hamsters by dextransulfate sodium and changes in intestinal microflora[J].Nihon Shokakibyo GakkaiZasshi,1985,82(5):1327-36

[12] Trivedi PJ,Bruns T,Ward S,et al.Intestinal CCL25expression is increased in colitisand correlates with inflammatory activity[J].J Autoimmun,2016(68): 98-104

[13] Friedlaender M H, Cyt R, Contactsensitivity in the guinea pig eye[J].Curr Eye

Res,1981, 1 (7) :403.

[14] 沈可欣,馬淑榮,李巖,等.惡唑酮誘導(dǎo)小鼠炎性腸病模型的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012(10):1804-6.

[15] Wang YH,Ge B,Yang XL,etal.Proanthocyanidins from grape seeds modulates the nuclear factor-kappa Bsignal transduction pathways in rats with TNBS-induced recurrent ulcerativecolitis[J].Int Immunopharmacol,2011,11 (10):1620-7.

[16] Li XL,Cai YQ,Qin H,et al.Therapeuticeffect and mechanism of proantho- cyanidins from grape seeds in rats withTNBS-induced ulcerative colitis[J].Can J Physiol Pharmacol,2008,86(12):841-9.

[17]譚琰,三硝基苯磺酸/乙醇與免疫復(fù)和物聯(lián)合誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動(dòng)物模型及其免疫機(jī)制的探討[D].華中科技大學(xué),2008.

[18]崔國(guó)寧,劉喜平,董俊剛,曾慶濤.潰瘍性結(jié)腸炎模型建立方法研究進(jìn)展[J].今日藥學(xué),2018,28(04):280-284.

[19]康宜兵,呂永慧,吳宇金,鐘志勇,武昕.免疫復(fù)合型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2015,36(10):55-57.

[20]吳玉泓,李海龍,段永強(qiáng),吳建軍,王宏偉,魏彥明.免疫致敏結(jié)合局部乙酸刺激法建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2010,18(01):65-68+65.

[21]Graeme P Young，D.James B.St John，Sidney J Winawer，et al.Choice of fecal occult blood tests for colorectalcancer screening: recommendations based on performance characteristics inpopulation studies[J]. The American Journal ofGastroenterology. 2002 (10)

[22]Wang Zhi-xue，DongBing，F(xiàn)eng Zi-fang，et al. A study on immune- omodulatory mechanism ofpolysaccharopeptide mediated by TLR4 signaling pathway[J]. BMC Immunol，2015，16（1）：34.

[23]Itana de Mattos，Pintoe Passos，Renata Lopes Britto.Diagnosisand treatment of müllerian malformations[J].Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology, 2020, 59(2).

[24]徐立,胡瑞斌,李兆波,等. STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠胰腺及肝臟石蠟切片HE染色改進(jìn)方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2019,35(09):1122-1124.

[25] Hilip Alex，Nicholas C Zachos，Thuan Nguyen，et al. Distinct cytokinepatterns identified from multiplexprofiles of murine DSS and TNBS-induced colitis[J]. NIH Public AccessAuthor Manuscript，2009，15（3）：341-352.

[26]宋曉敏,張丹參,莊忠寶,張海威,蘇曉梅,趙凱燕,張力.噁唑酮與三硝基苯磺酸聯(lián)用誘導(dǎo)小鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2016,6(03):17-23.

[27] 張丹參,王倩,田慧,薛貴平,張力.大黃栓制劑對(duì)兩種潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的作用研究[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2015,5(01):19-37.