該基因敲除小鼠可用于研究炎性疾病中的趨化因子受體。

動物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

Ccl3（趨化因子[C-C基序]配體3）（也稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白1a，Mip1a或Scya3）純合的小鼠敲除突變是可行且可育的。純合突變小鼠對柯薩奇病毒誘導(dǎo)的心肌炎有抵抗力。感染了流感病毒的突變小鼠顯示出減少的肺炎和延遲的病毒清除。沒有明顯的造血異常。在Ccl3tm1小鼠中，正畸牙齒移動過程中機(jī)械負(fù)荷引起的骨重塑顯著降低。與野生型小鼠相比，用四氯化碳或蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)肝纖維化可減少肝纖維化。在這些基因敲除小鼠中，黑色素瘤的生長增強(qiáng)，肺轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。然而，對于腎細(xì)胞癌，在這些基因缺陷的小鼠中，肺中轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量減少了，并且腫瘤內(nèi)新血管形成（一種不可或缺的轉(zhuǎn)移過程）減弱了。

實(shí)驗(yàn)動物：野生型AB品系斑馬魚，養(yǎng)殖溫度為28.5℃。

1.斑馬魚npsn的基因信息以及Cas9靶位點(diǎn)的確立

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫信息，npsn位于斑馬魚第7號染色體上，含有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中3個(gè)轉(zhuǎn)錄本npsn-001、-002和-003可以編碼蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄本npsn-004不可以編碼蛋白。我們通過對各個(gè)編碼蛋白轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列比對，發(fā)現(xiàn)三個(gè)轉(zhuǎn)錄本的編碼序列（coding sequence，CDS）大體相同，起始密碼子的位置都位于外顯子2上，由于剪切方式的不同產(chǎn)生了不同的終止子（如圖2所示）。

根據(jù)npsn各轉(zhuǎn)錄本編碼蛋白的共有序列以及Npsn蛋白的功能域預(yù)測，我們在npsn基因外顯子5和外顯子6上選取npsn-Cas9的靶位點(diǎn)（如圖2所示）。其中在npsn-exon5上選取的Cas9靶位點(diǎn)序列為5’-GGAGACATCGCCTTTCCCAG-3’，在npsn-exon6上選取的Cas9靶位點(diǎn)序列為5’-GGTCAGGTCGTGTCTCTCCAG-3’。

2. 用于CRISPER/Cas9敲除實(shí)驗(yàn)斑馬魚的準(zhǔn)備及靶位點(diǎn)SNP的檢測

首先挑選20對3 - 5月齡體型正常的AB野生型斑馬魚，并且每個(gè)Cas9靶位點(diǎn)預(yù)準(zhǔn)備10對斑馬魚進(jìn)行Cas9靶位點(diǎn)處是否存在SNP的檢測。我們首先在每個(gè)Cas9靶位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)PCR引物，

其中在npsn-exon5-Cas9處設(shè)計(jì)引物序列為：

F: 5’-GGACAGTGCTATTGCGTTTGG-3’，

R: 5’-GCCTTGTTCAATCACTGCTACTTC-3’，PCR產(chǎn)物長度為435 bp；

在npsn-exon6-Cas9處引物序列為：

F: 5’-TGCATTTTCTGTCATTTTCCTGTG-3’，

R: 5’-TGTTCTGATAGAGGATCCGGATG-3’，PCR產(chǎn)物長度為267 bp。

用眼科剪剪取少量斑馬魚尾鰭組織，先加入20 uL堿液（25 mM NaOH+ 200μM的EDTA（~ PH 12）），將樣品置于95 ℃水浴鍋中裂解30分鐘，在振蕩器上震碎組織，然后加入等體積的中和液40 mM的中和液（TRIS-HCL(~ PH 5)），離心，取上清液作為PCR反應(yīng)中的DNA模板。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件如下：

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小是否正確以及條帶是否特異。若PCR產(chǎn)物大小正確，并且條帶特異，可以將PCR產(chǎn)物送去公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，將PCR產(chǎn)物中有SNP的斑馬魚舍棄，留下無SNP的親本進(jìn)行下步npsn-Cas9敲除實(shí)驗(yàn)。同時(shí)送公司合成用于gRNA的制備的長片段引物FP（oligo），

其中npsn-exon5 oligo的序列為：

5’-TAATACGACTCACTATAggagacatcgcctttcccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’（T7啟動子序列 + Cas9靶位點(diǎn)序列 + gRNA - FP）；

npsn-exon6 oligo的序列為：

5’- TAATACGACTCACTATAggtcaggtcgtgtctctccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

3. Cas9 mRNA以及gRNA的制備

3.1 Cas9 mRNA的合成

1）pSP6-2sNLS-spCas9 載體的線性化：

10X CutSmart? Buffer：5 uL

Xba I： 1 uL

DNA (pSP6-2sNLS-spCas9)： 2 ug

ddH2O： up to 50 uL

37 ℃孵育4小時(shí)，取少量酶切產(chǎn)物電泳確定是否線性化完全，然后直接回收線性化產(chǎn)物。

2）體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9 mRNA：

按照SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ambion，AM1340）的說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，利用微量分光光度計(jì)檢測合成的Cas9 mRNA的濃度，然后將mRNA稀釋成600 ng/uL，并且分裝后于- 80 ℃冰箱長期保存。

3.2 gRNA的制備

1）gRNA DNA模板的制備：

取5 uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳來分析目的條帶是否單一，并且將PCR產(chǎn)物純化回收，用微量分光光度計(jì)分析回收產(chǎn)物的濃度，此DNA片段作為下步gRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板。

2）gRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成：

表1-2-3. 體外轉(zhuǎn)錄體系

Tab.1-2-3 in vitro transcription system

反應(yīng)體系混勻后，置于37 ℃孵育4 - 5小時(shí)。加入2 uL DNase I消化去除DNA模板，并且取1 uL反應(yīng)液進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢測模板DNA是否消化完全，以及大體估測產(chǎn)物gRNA的濃度。

3）gRNA的純化：

轉(zhuǎn)錄體系（20 uL）每管加500 uL TRIzol 試劑，震蕩混勻；

加100 uL三氯甲烷，手動搖晃15 s，常溫靜置3 min；

12000 X g，4度，離心15分鐘，取上清于新的EP管中；

加入等體積的異丙醇溶液，震蕩混勻，靜置10 min；

12000 X g，4度，離心10分鐘，去上清液，留沉淀；

向沉淀中加入1 mL的75 %的乙醇(溶于DEPC處理過的H2O)，震蕩混勻；

12000 X g，4度，離心5分鐘，去上清液，留沉淀；

待乙醇揮發(fā)干凈，加入5 uL的DEPC處理過的H2O；

用微量分光光度計(jì)測RNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳，以及稀釋成不同濃度的RNA用于顯微注射，剩余RNA儲液置于- 80 ℃冰箱內(nèi)長期保存。

3.3顯微注射

將Cas9mRNA（300 ng/ul）和gRNA（不同濃度梯度）按照體積比1 : 1混合，通過顯微注射方式注射入單細(xì)胞時(shí)期（出生后半小時(shí)內(nèi)）的斑馬魚魚卵中，液滴體積大小大約為0.5 nL。顯微注射后，更換新鮮的胚胎培養(yǎng)液。并且待胚胎發(fā)育至原腸胚時(shí)期，用吸管吸走死亡的胚胎，將存活的胚胎再次更換新鮮的胚胎培養(yǎng)液。

3.4 Cas9靶位點(diǎn)效率的檢測

采用T7 核酸內(nèi)切酶 I酶切法檢測Cas9靶位點(diǎn)的效率，T7 核酸內(nèi)切酶 I 可以識別并切割不完全配對 DNA、十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈 DNA，因此常用于突變體的檢測。具體如下：

取20顆大約24 hpf的小魚胚胎分別放置于96孔PCR板中，并且取4顆AB野生型胚胎作為對照組。吸干胚胎培養(yǎng)液，每孔加入20 uL的組織裂解液，樣品置于95 ℃水浴鍋內(nèi)裂解30分鐘，在振蕩器上震碎組織，然后加入等體積的中和液，離心，取上清液作為PCR模板。PCR反應(yīng)條件如下：

擴(kuò)增PCR產(chǎn)物利用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的特異性，將剩余的PCR產(chǎn)物置于98 ℃水浴鍋中水浴10分鐘（充分打開DNA的二級結(jié)構(gòu)），使其緩慢將至室溫，然后進(jìn)行T7 核酸內(nèi)切酶 I酶切反應(yīng)，酶切體系如下：

10 X NEB Buffer 2.1： 1 uL

PCR 產(chǎn)物： 4uL

T7E1酶:0.2 uL

ddH2O：up to 10 uL

37 ℃孵育2小時(shí)，電泳，確定條帶是否被切開，其中前20孔樣品是打了Cas9的實(shí)驗(yàn)組，后四個(gè)樣品為AB對照組。

npsn-exon5-Cas9的PCR產(chǎn)物大小為435 bp，對照組未被切開，進(jìn)一步說明了在此片段中不存在SNP，而實(shí)驗(yàn)組有部分DNA被切成220 bp左右的片段，這說明Cas9 mRNA在靶點(diǎn)處進(jìn)行了切割，并且產(chǎn)生了突變，并且根據(jù)DNA電泳條帶的亮度估測此位點(diǎn)的突變效率大約70 %（如圖3所示）。

npsn-exon6-Cas9的PCR產(chǎn)物大小為267 bp，對照組未被切開，進(jìn)一步說明了在此片段中不存在SNP，而實(shí)驗(yàn)組有部分DNA被切成150 bp和120 bp的DNA片段，這說明Cas9 mRNA在靶點(diǎn)處進(jìn)行了切割，并且產(chǎn)生了突變，并且根據(jù)DNA電泳條帶的亮度估測此位點(diǎn)的突變效率大約50 %（如圖4所示）。

圖3. npsn-exon5-cas9靶位點(diǎn)效率檢測結(jié)果

圖4. npsn-exon6-cas9靶位點(diǎn)效率檢測結(jié)果

4. 斑馬魚組織DNA的粗提。

1）將50 X的組織裂解液稀釋成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X組織裂解液，加入去離子水稀釋到10 mL溶液）；將50 X的中和液稀釋成1 X的工作液（吸取200 uL 50 X中和液，加入去離子水稀釋到10 mL溶液）

2）用吸管吸取斑馬魚胚胎于EP管中，并且用小量程的槍小心吸走多余液體，加入20 uL組織裂解液；

3）將EP管放入95 ℃水浴鍋內(nèi)裂解30分鐘；

4）震蕩EP管，使組織充分裂解；

5）向EP管中加入相同體積的中和液，震蕩混勻并且離心；

6）吸取上清液即可作為PCR反應(yīng)的模板。

5．npsn缺陷斑馬魚模型構(gòu)建結(jié)果檢測

我們設(shè)計(jì)Cas9靶點(diǎn)在npsn的exon5和exon6上，其中npsn-exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得（-7，+0）突變體（稱為npsnsmu5）（如圖5 A所示），在npsn-exon6-Cas9靶點(diǎn)獲得（-0，+1）突變體（稱為npsnsmu6）（如圖5 B所示）。npsnsmu5和npsnsmu6的純合突變體形態(tài)正常，能夠存活至成年，并且正常的進(jìn)行繁殖。

6．突變體中npsn mRNA表達(dá)變化檢測

為了檢測突變體中npsn mRNA的表達(dá)是否發(fā)生改變，我們利用npsn的整體原位雜交技術(shù)檢測npsnsmu5突變體中npsn mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，在npsnsmu5突變體中，npsn信號點(diǎn)幾乎檢測不到（如圖6 A所示），在npsnsmu6突變體中同樣出現(xiàn)npsn信號點(diǎn)的缺失。為了檢測npsnsmu5突變體中npsn是發(fā)生了部分降解還是全面降解，我們在突變位點(diǎn)的前面、后面以及包含突變點(diǎn)處分別設(shè)計(jì)qPCR的引物，經(jīng)qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，npsnsmu5中npsn的表達(dá)都下降到原來的5 %左右（如圖6 B所示），這說明npsnsmu5突變體中npsn mRNA發(fā)生了全面降解，這種降解可能是由于無義突變介導(dǎo)mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）引起的。

圖6. npsnsmu5突變體中npsn mRNA發(fā)生降解。

A. 3 dpf npsnsmu5突變體和同胞的npsn整體原位雜交。B. qRT-PCR檢測npsnsmu5突變體和同胞中npsn表達(dá)量的變化。

使用新霉素選擇盒替換目的基因5'非翻譯區(qū)的300個(gè)核苷酸的區(qū)域，全部外顯子1和部分外顯子2。將正確靶向的129個(gè)ES細(xì)胞注射入C57BL / 6J胚泡。