該模型通過埋植雌激素，進(jìn)而建立了皮膚型狼瘡動物模型，主要是檢測其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國際上尚欠缺類似模型，創(chuàng)新點在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。目前國際無報道。

無安全性問題。

1. Prkra 小耳小鼠外耳表型

通過飼養(yǎng)繁育得到5 只有表型的純合型Prkra小耳小鼠,其耳廓結(jié)構(gòu)都非常短小,發(fā)育明顯較其正常同胞耳廓小, 失去正常小鼠耳廓亞結(jié)構(gòu)形態(tài),其耳廓形態(tài)與人先天性小耳畸形比較類似,外耳道也比正常同胞窄小,小鼠外耳發(fā)育的差異在2 周齡時就很明顯。

2. Prkra 小耳小鼠骨骼阿利新藍(lán)染色

選取發(fā)育到40 d 的小耳小鼠和正常小鼠,剝皮處理,放入75%乙醇固定2 周,然后放入阿利新藍(lán)工作液中進(jìn)行軟骨染色2 d(根據(jù)樣品大小調(diào)整染色時間),再放入茜素紅工作液中染色1 d,放入1. 5%雙氧水溶液中進(jìn)行漂白(肉眼可見色素去除為標(biāo)準(zhǔn)),脫色后依次放入20%、40%、60%、80%的甘油進(jìn)行梯度透明各2 周,最后放入100%純甘油中進(jìn)行保存。

Prkra 小耳純合型突變小鼠骨骼發(fā)育受到明顯影響,體型較正常野生型小,四肢骨發(fā)育基本正常,但較細(xì)短,后肢表現(xiàn)尤為明顯。Prkra 小耳小鼠胸廓、肋骨數(shù)目基本正常,畸形小鼠肋骨發(fā)育較細(xì)小,尾骨發(fā)育較細(xì)短,頭顱發(fā)育略小。

Prkra小耳小鼠(B6.Cg-Prkralear)

1. Prkra小耳小鼠繁殖

小鼠飼養(yǎng)條件是按照普通常規(guī)鼠籠飼養(yǎng),每個籠不超過5 只小鼠。繁殖方式:用同窩的1 只雄性和1 只雌性交配獲得雜合小鼠,飼養(yǎng)到可以生育的成年鼠后,然后雜合與雜合再交配,得到?jīng)]有表型的雜合雌、雄小鼠。

2. Prkra 小耳小鼠的基因點突變檢測

DNA 測序:設(shè)計引物進(jìn)行Sanger 法測序,應(yīng)用試劑盒法裂解鼠尾提取DNA,洗脫出的DNA 于-20 ℃ 保存。通過引物3 在線平臺( http:/ /primer3.ut.ee/ )設(shè)計候選變異引物,Prkra 正向引物為TTCAGTAGCGAGCCAGCAC,反向引物為ACAAC

TGTCCGCTCTGTCG。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)體系:金牌Mix(green)27 μl,正向引物1 μl,反向引物1 μl,模板DNA 1 μl。

Prkra 小耳小鼠野生型(上)、雜合型(中)和純合型(下)的測序峰圖,突變位點為在2 號染色體76、643、218 bp(GRCm38)上的G 向A 的突變,該突變位點位于第3 外顯子之后

小耳畸形的病因目前還不完全明確，環(huán)境和遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的重點。先天性小耳畸形在基因突變致病性研究方面還沒有闡明小耳畸形胚胎發(fā)育的機(jī)制。小耳畸形主要涉及胚胎發(fā)育期間第一和第二鰓弓的異常，主要表型涉及外耳發(fā)育異常。外耳的耳廓是由第一和第二鰓弓的逐漸融合形成的，在發(fā)育過程中第一和第二鰓弓之間是相互作用，兩弓之間的凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的起源來分析，外耳的發(fā)育至少在一定程度上是由第一和第二鰓弓通過后腦的部分區(qū)域來介導(dǎo)的，后腦是鰓弓的神經(jīng)嵴細(xì)胞的來源，在后腦的第四段基因突變可以導(dǎo)致外耳的發(fā)育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的先天發(fā)育性結(jié)構(gòu)異常，其嚴(yán)重程度主要表現(xiàn)為從輕度結(jié)構(gòu)異常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狹窄和外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常， 畸形嚴(yán)重者耳廓全部消失， 絕大多數(shù)患者僅遺留花生狀或貝殼狀的殘耳組織。同時一些小耳畸形患者也常合并顱面部畸形，中耳及半側(cè)顏面骨及軟組織發(fā)育不良等。

Prkra 小耳小鼠屬于自發(fā)性突變,純合型小鼠在2 周齡時即可見耳廓較小,身長尺寸比正常稍小。純合型小鼠生長速度比雜合型或野生型同窩小鼠慢,成熟后不能生育,所以該品系主要靠雜合子與雜合子交配來繁育,獲得實驗所需的純合型小鼠。Prkra 小耳小鼠突變位點為在2 號染色體76、643、218 bp(GRCm38)上的G向A 的突變轉(zhuǎn)換,位于第3 外顯子之后,這可能會影響前體pre-mRNA 的剪接。